本发明涉及一种Ｉ型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒，同时还涉及一种该试剂盒的检测方法和应用，其中试剂盒包括：经重组ＶＰ１蛋白包被的酶标板、辣根过氧化酶标记的兔抗鸭ＩｇＧ抗体、ＴＭＢ底物显色液、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。本发明利用聚合酶链反应从ＤＨＶ－１基因组中扩增出ＶＰ１基因，构建了含ＶＰ１基因的重组表达质粒ｐＥＴ３２ａ－ＶＰ１，该质粒转化入宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），体外表达ＶＰ１蛋白经镍柱纯化后作为抗原，建立酶联免疫吸附试验检测试剂盒，阳性血清为Ｉ型鸭肝炎病毒标准阳性血清，阴性对照为鸭标准阴性血清。检测试剂盒特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，在Ｉ型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要应用价值。