甲型H1N1流感病毒的鸡胚分离方法

一、目的

流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保鸡胚分离甲型H1N1病毒的操纵正确、规范和可靠而制定。

二、操纵程序

（一）生物安全要求

甲型H1N1病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3，实验操纵职员需进行BSL-3级防护。甲型H1N1病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操纵必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。

（二）材料

1、9～10日龄SPF鸡胚

2、照卵灯

3、70%～75％酒精

4、一次性1ml注射器，22号针头

5、鸡卵开孔器

6、胶水或医用胶布

7、15mL无菌离心管、试管架

8、10mL无菌移液管

9、无菌镊子

（三）实验步骤

1、验卵

1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。假如鸡胚是死胚、没有受精、有裂缝、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。

2）如何判定鸡胚状态

（1）血管：活胚血管清楚，死胚模糊，成淤血带或淤血块

（2）胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动。

（3）绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。

2、接种鸡胚尿囊腔和羊膜腔

1）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。

2）用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔。每份标本接种3枚鸡胚。

3）用1ml注射器吸200μL处理过的临床标本，装上22号针头。

4）将鸡胚置于蛋架上，针头完全进进鸡胚，刺破鸡胚羊膜，将100 μl临床标本注进鸡胚羊膜腔。然后将针头退出至针头的一半，将另外100 μl临床标本注进鸡胚尿囊腔。

5）用同一注射器将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。

6）用注射器反复吸取2‰次氯酸钠消毒液2~3次后，将针头放于毁形器中销毁，注射器针筒弃于锐器盒中。

7）用胶水或者消毒过的医用胶布封口。

8）甲型H1N1病毒35℃培养，培养鸡胚2～3天。鸡胚进行病毒分离培养时，天天检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，以为是非特异死亡应弃往。
3、鸡胚尿囊液和羊水的收获

1）鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4h以上。

2）标记15mL无菌离心管与相应的鸡胚编号一致。用70%～75％酒精消毒鸡胚气室端。

3）用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。用10mL 无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用移液管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并。

4）收获病毒培养液后的鸡胚在生物安全柜内装进密封袋，然后进行高压处理。

5）将鸡胚收获液3000rpm离心5min往除血液和细胞。然后进行红细胞凝集实验，如没有红细胞凝集现象，应将收获病毒培养液再鸡胚传代2次。

6）假如有必要，可再通过血凝抑制实验鉴定分离物，并将分离物保存在-70℃或-70℃以下。

4、留意事项

1）不要在-20℃条件下保存病毒分离物，由于该温度条件下甲型H1N1病毒极不稳定。

2）甲型H1N1病毒分离操纵严格按照生物安全规程的要求。禁止在同一实验室，同一时间接种未知临床标本和已知其他亚型标准病毒。禁止在同一实验室，同一时间接种来自不同动物的标本。动物标本（如猪、禽等）必须与人的标天职别保存。