主题：检验EM和光合细菌中有效微生物数量的方法

由于目前当地的检验设备和技术水平是很难把EM中80多种微生物全部分离培养一一查验，只能简单地利用显微镜或[1]油镜I（500倍以上）等一些设备计算出每毫升EM中有效微生物的菌数。其标准是：EM每毫升含有效菌数一亿以上、光合细菌每毫升含有效菌数30亿以上即为合格。

具体操作如下（以下是光合细菌的操作，检验EM的方法相同）：

常用的方法有两种：一种是血球计数板法，另一种是光密度法。

⑴血球计数板的构造：血球计数板是由一块比普通玻璃厚的载玻片特制而成的，板的中间有一个"H"形凹槽，该凹槽围成两块平台，每块平台的中央部位各有一个正方形的小凹槽，小凹槽深0.1毫米。正方形凹槽底部画有大、中、小方格，其中大方格为3×3＝9个，每个大方格的面积是1增方毫米，所以加上盖玻片后，每个大方格上即形成体积为0.1产方毫米的空间。每个大方格又分成4×4＝16个中方格；在中央大方格的每一个中方格又分成5×5＝25个小方格，因此中央大方格共分成25×16＝400个小方格。有的计数板是把中央的大方格分成5×5＝25个中方格，每个中方格再分成4×4＝16个小方格，中央大方格仍然为16×25＝400个小方格。把中央大方格的中方格再分成小方格的分割线并不只局限于中央大方格内， 而是一直延伸到正方形凹槽的边缘，故在其延长线上的4个大方格中分割线显得密集。

⑵血球计数板计数操作方法。

①取样：先清洗一个容量为30～50毫升的取样瓶或烧杯。由于光合细菌在培养液中的分布是不均匀的，尤其是具有强烈运动能力的种类更明显，所以在取样前必须充气或搅拌，待分布均匀后，立即用移液管（移液管应预先进行消毒处理，以免造成污染）取样，取样的量为10～15毫升。如果取样的密度太大，计数困难，必须加水稀释到适宜浓度后方可计数。

②样品放于计数板：放置前必须将血球计数板和盖玻片清洗干净、擦干，不能有油污染和杂质。将血球计数板平放在桌子上，盖好盖玻片；然后把样品瓶轻轻摇动几下，使光合细菌分布均匀，并立即用干净的微吸管取样品，迅速把微细吸管放到盖玻片的边缘处，轻压微细吸管的橡皮帽，使样品流入计数板内。注意控制样品流入量，不能过多，过多则流入到沟内；也不能过少，过少则计数时不准确（计数后的数量一般偏少），应充满画线方格及其周边部分。还应注意盖玻片下不能有气泡存在，否则会造成计数不准确。不符合操作要求时，应立即重新开始。样品吸入血球计数板后，稍停1分钟，待细菌沉降在玻片表面上再在显微镜下进行计数。

③计数：光合细菌的计数，必须使用油镜才能观察清楚。可以计数中央大格的4个角的中格，每个中格有25个小格，逐一计数，4个中格相加共计数100个小格。计数时应从计数框一角开始，在计数框边缘的标本应按"计上不计下、计左不计右"的原则，计数出细菌的总量后，按下式计算出每毫升菌液中的细菌数量：细菌数量＝100个小格的细菌数×4×10000×稀释倍数。

注意每个样品最少重复计数两次，然后取其平均值，计算细菌的数量，两次计数结果和平均数之差应不大于其平均数偏差的10％才有效。

因为盖玻片下每个大方格上的空间为0.1立方毫米，故1个大方格内的细菌数量若为n，则细菌密度为每立毫米10n个，将此换算为每毫升的细菌数量，则需乘以10000，因此1个大方格内细菌平均数是多少，则细菌的密度就是每毫升多少万个。如果计数前经过稀释，则需乘以稀释倍数。

例如：吸取待测的光合细菌菌液1毫升，加水19毫升稀释，计数100个小格内的细菌数量为500个，则每毫升菌液的光合细菌数量为：

细菌数量＝500×4×10000×（19＋1）＝4×108＝4亿（个）。

血球计数板计数法具有简便的优点，因而得到了广泛应用。

⒉光密度法 光密度法的依据是光合细菌的吸光值与其密度相关。测定前先对已知密度的一系列不同密度的细菌菌液用光电比色计分别测定其吸光值，绘制出"吸光值—光合细菌密度"的相关曲线，即工作曲线。工作曲线做好后，只要测定出光合细菌菌液的吸光值，就可以从工作曲线上查出其密度。因为光合细菌的密度与吸光值有对应关系，故某一吸光值实际上就表示某一细菌的密度，因此也可以直接用吸光值来表示细菌的密度。用来表示细菌密度的吸光值，称为光密度值。

为了提高光密度法的准确度，应选择在各种光合细菌的吸光度最大的波长上测定，吸光值的范围尽量选用0.1～0.8之间。同一密度的光合细菌，由于培养条件、生长状况不同，其吸光值并不完全相同。因此，按照同一工作曲线查出的细菌密度可能出现一定误差，这是光密度法的缺点。该法的优点是快捷，特别适用于大量样品的测定。

可以的。