本发明涉及一种I型鸭肝炎病毒血清抗体酶联免疫法检测试剂盒,同时还涉及一种该试剂盒的检测方法和应用,其中试剂盒包括:经重组VP1蛋白包被的酶标板、辣根过氧化酶标记的兔抗鸭IgG抗体、TMB底物显色液、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。本发明利用聚合酶链反应从DHV-1基因组中扩增出VP1基因,构建了含VP1基因的重组表达质粒pET32a-VP1,该质粒转化入宿主菌BL21(DE3),体外表达VP1蛋白经镍柱纯化后作为抗原,建立酶联免疫吸附试验检测试剂盒,阳性血清为I型鸭肝炎病毒标准阳性血清,阴性对照为鸭标准阴性血清。检测试剂盒特异性强、敏感性高、操作简单,易于大范围推广应用,在I型鸭病毒性肝炎的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要应用价值。