由于急性、典型新城疫的症状和病变与高致病力禽流感十分相似，因此，仅凭症状与病变很难作出准确的诊断。可参考鸡群的免疫程序和血凝抑制抗体滴度作出判断，如已有明显的新城疫临床症状和病理变化，而又有新城疫免疫失败，抗体滴度很低的记录，则可初步判断为新城疫。至于非典型新城疫，由于其呼吸道症状与传染性支气管炎、传染性喉气管炎、支原体感染和非高致病力禽流感相似，而减蛋综合征、禽流感等多种疾病均可引起产蛋下降，所以凭临床症状和病理变化很难作出非典型新城疫的初步诊断，必须进行病毒分离鉴定和其他的实验室诊断才能确诊。
（一）病毒分离与初步鉴定 可采集病、死鸡的气管、支气管、肺、肝、脾、粪便、肠内容物或泄殖腔和喉气管拭子作为分离病毒的样品，对于慢性和非典型病例，可采集脑组织。将病料研磨成乳剂，按1∶5加入生理盐水稀释成悬液，离心后用过滤器除菌或加庆大霉素等抗生素除菌。首次分离病毒最好经尿囊腔途径接种9～10日龄鸡胚，最好是SPF鸡胚或非免疫鸡胚，接种后置
（二）病毒的进一步鉴定 因禽流感病毒、减蛋综合征等其它一些病毒也具有凝集鸡红细胞的活性，所以在HA呈阳性后，还必须用新城疫抗血清对分离的病毒进行红细胞凝集抑制试验（HI试验），最好同时分别用新城疫、禽流感和减蛋综合征的抗血清与分离物做HI试验。如果新城疫抗血清能抑制被分离物的HA活性，而其它血清不能将其抑制，则被分离的病毒为新城疫病毒；如病毒的HA活性分别能被新城疫及禽流感的抗血清所抑制，则提示分离物中在感染了新城疫的同时还合并感染了禽流感。在确定为新城疫病毒后，还必须进行病毒的毒力测定，以确定被分离的病毒是野外强毒还是疫苗株病毒。作为一般生产性诊断，可将分离的病毒接种非免疫鸡或SPF鸡，如果病毒能致死敏感鸡，则可确诊。
必要时也可进一步作致病指数的测定，包括鸡胚平均死亡时间（MDT）、脑内接种指数（ICPI）、静脉接种指数（IVPI）、已凝集的红细胞洗脱速度、蚀斑形成特点、病毒基因序列分析等。
（三）其他诊断方法 其他诊断方法包括红细胞凝集抑制试验（HI）、血清中和试验、免疫荧光抗体、酶联免疫吸附试验（ELISA）、单克隆抗体技术、核酸探针等分子生物学技术等。由于目前鸡群已普遍接种新城疫的疫苗，血清学方法如未能区分抗体来自疫苗还是野外病毒之前，必须比较感染前后的抗体滴度是否有明显上升，才具有诊断意义。