李洁明，孙红文*，王翠苹，李阳，张彦峰，张清敏
(南开大学环境科学与工程学院，环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津 300071；
*联系人，E-mail:sunhongwen@nankai.edu.cn)
1. 引言
蚯蚓是广泛存在的大型土壤动物，在自然界的物质循环和生态平衡中起着巨大作用，并在很多方面影响着土壤微生物。现实环境中土壤微生物对有机污染物的降解净化作用是在蚯蚓的参与下共同完成的。但是在对污染环境的修复方面，蚯蚓未得到足够应用，国内外相关的研究还很少。芘作为土壤中常见的持久性有机污染物，具致畸、致癌和致突变特性，会给生态系统和人体健康带来巨大危害。本研究通过微宇宙实验，研究蚯蚓对土壤中芘的微生物降解的促进作用，为开发蚯蚓辅助微生物修复芘污染土壤的原位技术提供理论支持。
2. 材料与方法
2.1 实验材料
供试微生物为本实验室保存的具高效降解芘性能的芽孢杆菌。供试土壤红壤和潮土风干后过10目筛，湿热灭菌，备用。灭菌后的红壤和潮土的土壤有机质分别为0.30%和3.56%，粘粒含量分别为21%和34%。2种土壤中芘的背景值未检出。蚯蚓Eisenia foetida采回后在供试土壤中进行20d的驯化，清肠后挑选湿重约600mg、具环带的健壮成蚓作为实验动物。
2.2 实验设计
降解实验：对土样染毒，浓度为 9 mg·kg-1，避光放置24 h和60 d，分别得到新鲜染毒和老化的土壤。菌悬液的制备参照文献[3]。调解菌悬液的OD600=1.0。
设2个实验组。无蚯蚓组：10 g染毒土壤中加入1.5 mL菌悬液和2 mL无机盐培养基，加盖后30℃避光培养，定期将土样全部取出，萃取，测定其中芘的残留量。引入蚯蚓组：向与无蚯蚓组相同的微宇宙中加入4条蚯蚓，定期将土样和蚯蚓全部取出，其他操作相同。空白对照：以 1.5 mL磷酸缓冲液代替菌悬液，其他操作与无蚯蚓组相同。每一处理均为3个重复。
解吸实验：向土样中投加蚯蚓，密度与降解实验同，用无菌水调节土壤湿度，30d后将蚯蚓全部取出，土壤风干后过10目筛，将1g蚯蚓处理干土和20ml NaN3溶液加入玻璃离心管中，染毒浓度为4 mg·kg-1干土，振荡48h吸附达平衡；之后每一处理加入0.2gTenax，振荡，定时将Tenax全部取出，萃取，测定其中芘含量。未经蚯蚓处理的原土样做空白对照。每一处理均为3个重复。
各种样品的萃取液经旋转蒸发、吹干，用甲醇定容。芘浓度采用HLPC法测定。
3. 结果与讨论
3.1 新鲜染毒和老化土壤中芘的微生物降解
新鲜染毒红壤和潮土的无蚯蚓组中14 d后芘降解率分别为41.78%和27.02%。潮土有机质和黏粒含量均较高，会使芘更多地成为吸附态，在一定程度上阻碍了微生物的降解，因此潮土中芘降解率较低。老化的红壤和潮土的无蚯蚓组中14 d后芘降解率分别只有36.53%和20.50%，较新鲜染毒土壤出现了不同程度的下降。据文献，老化会使一部分芘分子从相对易扩散和解吸的结合点位向相对难扩散和解吸的点位移动，即芘的土壤结合状态发生了变化，从而降低了其生物有效性。
3.2 引入蚯蚓组中芘的去除
所有处理中均无死亡蚯蚓个体出现。研究结果表明，蚯蚓对新鲜染毒和老化土壤中芘去除的促进作用归因于2方面，即增强的微生物降解作用以及蚯蚓自身对芘的生物富集作用（表1）。新鲜染毒红壤和潮土的引入蚯蚓组中14 d后芘微生物降解率分别提高了9.70%和14.61%，芘去除率也分别达到了89.24%和57.53%，较无蚯蚓组提高了47.46%和30.51%；老化红壤和潮土的引入蚯蚓组中14 d后芘微生物降解率分别提高了18.90%和12.33%，芘去除率也分别达到了91.93%和45.46%，较无蚯蚓组提高了55.40%和24.96%。
表3 引入蚯蚓组中各种作用对芘去除率的贡献 [ 表示为“均值±标准误差”]
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处理第2天 |
处理第4天 |
处理第7天 |
处理第14天 |
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新鲜染毒红壤 |
微生物降解 |
29.46%±2.13% |
34.67%±5.29% |
42.65%±1.33% |
51.48%±5.89% |
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蚯蚓富集 |
18.45%±2.40% |
30.53%±2.24% |
35.90%±0.92% |
37.76%±6.39% |
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新鲜染毒潮土 |
微生物降解 |
31.82%±5.71% |
34.00%±3.37% |
35.48%±5.87% |
41.63%±3.38% |
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蚯蚓富集 |
15.05%±7.41% |
14.69%±1.73% |
13.75%±0.82% |
15.90%±0.96% |
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老化
红壤 |
微生物降解 |
27.40%±8.78% |
38.54%±1.75% |
44.46%±2.96% |
54.43%±9.81% |
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蚯蚓富集 |
12.79%±9.77% |
31.52%±1.47% |
36.99%±3.19% |
37.50%±1.33% |
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老化
潮土 |
微生物降解 |
18.65%±7.28% |
21.53%±10.35% |
25.15%±5.76% |
32.83%±6.71% |
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蚯蚓富集 |
10.69%±1.73% |
13.95%±0.66% |
12.71%±0.64% |
12.63%±0.01% |
3.3 蚯蚓活动对土壤芘的解吸率的影响
由图1可见，蚯蚓处理的土壤中解吸率明显提高。处理后的潮土和红壤21d芘解吸率分别达到了80.92%和91.64%，较未经蚯蚓处理的原土提高了36.07%和24.49%。这说明蚯蚓活动可能改变了土壤的有机质组成等理化性质，从而使芘的结合状态发生变化，从而提高了解吸率，一定程度上反映了生物有效性的提高，可以解释本研究中蚯蚓促进微生物降解的现象。
4. 结论
有机质较高的土壤中芘的降解率较低。老化作用降低了芘的微生物降解性。在本研究的实验条件下，蚯蚓可以促进土壤中芘的微生物降解。蚯蚓的引入对土壤中的芘修复效率大大提高，归因于增强的微生物降解和蚯蚓自身的生物富集两方面作用。蚯蚓处理的土壤中芘的解吸率大大提高。
致谢
本工作受国家自然科学基金重点项目（20737002）资助。
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